Qualitative and Quantitative Real-Time PCR

 


ในช่วง 18 ปีหลังจาก Dr. Mullis, นักวิทยาศาสตร์ บริษัท Cetus ได้ค้นพบปฏิกริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส (Polymerase Chain Reaction) หรือ PCR ในปี ค.ศ. 1985, PCR ได้ถูกนำมาประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางในงานวิจัย และการตรวจวินิจฉัยในห้องปฏิบัติการเพื่อสืบค้นดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอเป้าหมายจากสิ่งส่งตรวจ ช่วยให้เราสามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเป้าหมายในหลอดทดลองจากเพียงไม่กี่โมเลกุลเป็นระดับแสนหรือล้านโมเลกุลในเวลาไม่เกิน 24 ชั่วโมง อย่างไรก็ดีมีข้อจำกัดหรือข้อด้อยของกระบวนการ PCR ดั้งเดิม (Conventional PCR) หลายประการเช่นกัน ตัวอย่างเช่น

  1. ต้องใช้เวลา 2-3 ชั่วโมงในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดทดลองด้วยเครื่องปรับเปลี่ยนอุณหภูมิอัตโมมัติ (Thermocycler) และอีก 1-2 ชั่วโมงในการตรวจวิเคราะห์ amplified DNA ด้วยเทคนิค agarose gel electrophoresis ซึ่งล่าช้าเกินกว่าจะสามารถนำมาประยุกต์ใช้ในการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติที่ต้องการผลเร่งด่วนได้ เช่นการตรวจหาเชื้อจุลชีพและไวรัสที่ก่อให้เกิดอาการเยื่อหุ้มสมองอักเสบ
  2. การตรวจสอบ amplified product หรือดีเอ็นเอเป้าหมายที่ได้จากกระบวนการ PCR โดยวิธี agarose gel electrophoresis นอกจากจะใช้เวลานาน (1-2 ชั่วโมง) แล้ว ยังก่อให้เกิดการฟุ้งกระจายและการปนเปื้อนของ amplified product ไปทั่วบริเวณ ซึ่งเป็นสาเหตุสำคัญที่ทำให้เกิดผลบวกปลอม (false positive) อันเนื่องมาจาก carry over contamination
  3. การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายในหลอดทดลองด้วยเครื่องปรับเปลี่ยนอุณหภูมิอัตโนมัติ (Thermocycler), amplified product ที่ได้จะถูกนำมาวิเคราะห์ด้วยการใช้กระแสร์ไฟฟ้าเหนี่ยวนำให้เคลื่อนตัวผ่านแผ่นวุ้น (agarose gel elctrophoresis), จากนั้นแผ่นวุ้นจะถูกนำมาย้อมด้วยสารละลาย EtBr ซึ่งจะแทรกตัวเข้าไปอยู่ระหว่างสายคู่ของดีเอ็นเอ เมื่อถูกกระตุ้น (excite) ด้วยแสง UV สามารถเรื่องแสง (emit)เป็นแถบให้สามารถมองเห็นหรือถ่ายภาพได้

  4. เพื่อเพิ่มความถูกต้องและแม่นยำของการตรวจ มีการใช้ ดีเอ็นเอ ตรวจตาม (nucleic acid probe) ที่ติดฉลากด้วยสารรังสีหรือสารปลอดรังสี เข้า hybridize กับ amplified product ที่ตรึงติด (fix) บนกระดาษกรอง nylon เช่น การทำ dot blot หรือ Southern blot hybridization ซึ่งขั้นตอนดังกล่าวใช้เวลาประมาณ 2-3วัน และยังก่อให้เกิดการฟุ้งกระจายและการปนเปื้อนของ amplified product ไปทั่วบริเวณ ซึ่งเป็นตัวการสำคัญในการเกิด carry over contamination เช่นกัน
  5. Southern blot hybridization เป็นการนำ ดีเอ็นเอที่ได้จากการะบวนการ PCR เหนี่ยวนำด้วยกระแสร์ไฟฟ้าให้เคลื่อนตัวผ่านแผ่นวุ้น, ปิดทับแผ่นวุ้นด้วยกระดาษกรองหลายชั้นที่เปียกชุ่มด้วยสารละลายบัฟเฟอร์และทิ้งข้ามคืน ดีเอ็นเอในแผ่นวุ้นจะถูกดูดชับ เคลื่อนตัวไปเกาะติดบนแผ่นกรอง nylon หรือ nitrocellulose, นำแผ่นกรอง nylon/nitrocellulose เติม hybridization buffer และ probe ติดฉลากด้วยเอ็นไซม์ เข้า hybridize กับ amplified product บนแผ่นกรองดังกล่าว, จากนั้นตรวจจับ hybridization signal ด้วยการเติม chemiluminescent substrate, เอ็นไซม์จาก porbe จะย่อย chemiluminescent substrate เกิดแสงเรืองขึ้นซึ่งสามารถตรวจจับด้วยการประกบกับแผ่น X-ray film.

  6. กระบวนการ PCR แบบดั้งเดิมไม่สามารถบอกปริมาณดีเอ็นเอตั้งต้น (quantitative) บอกได้แต่เพียงว่ามีดีเอ็นเอเป้าหมายอยู่ในสิ่งส่งตรวจนั้นหรือไม่ (qualitative) เท่านั้น

ปัจจุบันเทคโนโลยี PCR ได้ พัฒนาขึ้นไปอีกระดับหนึ่งในรูปของ Real-time PCR สามารถแก้ไขข้อจำกัดต่างๆที่กล่าวมาข้างต้นลงได้ กล่าวคือ

  1. มีการเปลี่ยนการทำ PCR ในหลอด plastic (microcentrifuge tube) มาเป็นหลอดแก้ว capillary ขนาดเล็ก ซึ่งสามารถถ่ายเทความร้อนได้ดีกว่าหลอด plastic สามารถปรับเปลี่ยนอุณหภูมิได้อย่างรวดเร็ว (20° C/1 วินาที) การเพิ่มขยายดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอเป้าหมายจำนวน 30-40 รอบ (cycle) ใช้เวลาเพียง 30-40 นาที
  2. หลอดแก้ว capillary ซึ่งมาใช้แทนหลอด plastic ในกระบวนการ PCR, มีคุณสมบัติถ่ายเทความร้อนได้ดีและแสงผ่านได้,

    เครื่อง Thermocycler รุ่นใหม่ ที่สามารถตรวจจับการเรื่องแสงของ DNA Binding Dye SYBR Green I และ Hybridization Probes ระหว่างกระบวนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดแก้ว capillary, probe ติดฉลาก สาร fluorochrome ใน PCR reaction mixture สามารถถูก excite ด้วย LCD light source และemit พลังงานออกมาในรูปของแสงในอีกช่วงเคลื่อน ซึ่ง filter ภายในเครื่อง Thermocycler จะกรองรับนำไปวเคราะห์ผล

  3. การตรวจสอบ amplified product หรือดีเอ็นเอเป้าหมายที่ถูกเพิ่มปริมาณขึ้นในหลอดแก้ว capillary สามารถทราบผลได้ในเวลาไม่กี่วินาทีหลังจากกระบวนการ PCR เสร็จสิ้นลง โดยแสดงเป็นค่า Tm (melting temperature) ของ amplified product นั้นๆ
    1. การตรวจสอบ amplified DNA ด้วย SYBR Green I Dye
    2. SYBR Green I เป็นสาร Fluorochrome ประเภทหนึ่ง สามารถเข้าจับกับ minor groove ของดีเอ็นเอสายคู่ เมื่อถูกกระตุ้น (excite) ด้วยแสง UV จะมีการคายพลังงาน (emission) ออกมาในรูปของแสงfluorescence ช่วงคลื่น (l )ยาวขึ้น สามารถตรวจจับได้ด้วย optical filter ที่ติดตั้งอยู่กับเครื่อง Real-Time Thermocycler ทั้งนี้เราสามารถแยก fluorescence signal ที่เกิดจาก primer-dimer ออกจาก specific amplified DNA ได้อย่างง่ายดายด้วยการเปรียบเทียบค่า Tm, ค่า Tm เป็นคุณสมบัติเฉพาะของดีเอ็นเอสายคู่แต่ละสาย แปรผันโดยตรงกับ % GC content สามารถคำนวณได้ จาก fluoresce signal ที่ลดลงเมื่อเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นอย่างต่อเนื่อง, unspecific products จะมีค่า Tm ต่ำเนื่องจากมีขนาดสั้น (15-30 bp) ต่างจาก amplified DNA ซึ่งจะมีขนาดยาวกว่า (>100 bp) และมีค่า Tm ที่สูงกว่า

      ภาพจำลองแสดงการแทรกตัวของ SYBR Green I เข้าที่ minor groove ของ ดีเอ็นเอเกลียวคู่

      ในช่วงของการ denature เพื่อสลายดีเอ็นเอสายคู่ให้เป็นสายเดี่ยว, SYBR Green I ยังไม่สามารถเข้าไปจับกับสายดีเอ็นเอสายเดี่ยวได้

      เมื่อ PCR primer เข้าจับและสร้างดีเอ็นเอสายใหม่, SYBR Green I จะเริ่มสอดแทรกเข้าสู่สายคู่ของดีเอ็นเอและจะมีการเรื่องแสง (emission) เมื่อถูกกระตุ้น (excite) ด้วยแสง UV

      ในช่วง DNA elongation จะมี SYBR Green I เข้าแทรกในดีเอ็นเอสายเป็นจำนวนมาก เราสามารถใช้ optical filter ของเครื่อง Real-Time Thermocycler ตรวจจับการเรืองแสงอย่างต่อเนื่องแบบ real-time ได้ เมื่อ PCR cycle เวียนกลับมาสู่ช่วงของการ denature, SYBR Green I จะหลุดออกจากสายดีเอ็นเอ, การเรื่องแสงจะลดลง

      การตรวจวัดแสง fluorescence ในช่วงท้ายของ elongation step ของ PCR ในทุก cycle จะทำให้สามารถ monitor ปริมาณของ amplified DNA ที่เพิ่มขึ้นได้ ในกราฟแสดงให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่าง fluorescence intensity และ จำนวน PCR cycler ที่เพิ่มขึ้น หากดีเอ็นเอตั้งต้นมีปริมาณมาก จะสามารถตรวจจับ fluorescent signal จาก amplified DNA ในช่วงต้นของกระบวนการ PCR หาก template มีปริมาณเพียงไม่กี่โมเลกุล จะตรวจจับ fluorescent signal ได้ใน cycle ท้ายๆ รวมทั้ง fluorescent signal จาก unspecific products ซึ่งเกิดจาก primer dimer

      nonspecific product ที่เกิดขึ้นระหว่างกระบวนการ PCR เช่น primer-dimer จะมีค่า Tm ต่ำกว่า Tm ของ amplified DNA สามารถแยกจากกันได้ง่าย

      amplified product ที่เกิดจากการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมบางส่วนของ hepatitis B virus (HBV) และ herpes simplex virus (HSV) แม้จะมีขนาด amplicon 250 bp เท่ากัน แต่มีค่า Tm ต่างกัน โดย HSV จะมีค่าสูงกว่าเนื่องจากมีค่า GC content สูงกว่า จากภาพจะเห็นได้ว่า amplified DNA ของ HSV ขนาด 500 bp จะมีค่าTm ~ 92° C ซึ่งสูงกว่า amplified DNA ของ HSV (90° C) และHBV (85° C) ขนาด 250 bp

    3. การตรวจสอบ amplified DNA ด้วย probes ติดฉลากสาร fluorochrome โดยอาศัยเทคโนโลยีของ Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
    4. Probe ติดฉลากสาร Fluorochrome จะถูกนำมาใช้เมื่อต้องการความจำเพาะสูงสุด เช่นการบ่งชี้ single nucleotide mutations ในดีเอ็นเอเป้าหมาย ซึ่งไม่สามารถกระทำได้โดยการใช้ SYBR Green I Dye โดยนำ Fluorochrome 2 ประเภทติดฉลากเข้ากับสายของ specific Probe

      Fluorochrome ทั้ง 2 มีโอกาสอยู่ใกล้กันในระยะ 2-5 bp กัน จะสามารถถ่ายเทพลังงานจาก donor มาสู่ acceptor โดยไม่สูญเสียพลังงานออกมาสู่ระบบภายนอกในรูปของพลังงานแสงหรือความร้อน

      เมื่อถูกกระตุ้นด้วยแสงพลังงานสูง Fluorochrome ตัวแรก (Quencher) จะดูดซับพลังงานเอาไว้ และถ่ายทอดพลังงานให้ Fluorochrome ตัวที่สอง (Reporter dye) โดยไม่สูญเสียพลังงานออกมาสู่ระบบภายนอก reporter molecule เมื่อได้รับพลังงานจาก Quencher จะปลดปล่อยพลังงานออกมาสู่ระบบภายนอกในรูปของแสง ซึ่งเราสามารถตรวจวัดได้ ปฏิกิริยาดังกล่าวเรียกว่า Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET)

      การติดฉลาก Fluorochrome เข้ากับตัว Probe เพื่อให้เครื่อง Real-time PCR สามารถตรวจจับ fluorescence signal อันเกิดจากปฏิกิริยา FRET สามารถกระทำได้ในหลายลักษณะ เช่น

      1. Hybridization probe
      2. โดยการใช้ Oligonucleotide Probe สายสั้นสองสาย โดยสายแรกติดฉลากที่ปลายข้าง 3’ ด้วย Fluorescein และสายที่สองติดฉลากด้วย สาร Red 640 หรือ Red 705 เข้าที่ปลาย 5’ โดยที่ปลาย 3’ ของ Oligonucleotide Probe สายที่สองจะถูกปิดด้วย Phosphate Group เพื่อไม่ให้ สามารถทำหน้าที่เป็น PCR primer ได้ ทั้งนี้ Probe ทั้งสองเส้นจะมีลำดับเบสต่อเนื่องกันโดยเว้นช่วงระหว่าง ปลาย 3’ ของ Oligonucleotide Probe เส้นแรก กับ ปลาย 5’ ของ Probe อีกเส้นหนึ่งประมาณ 1-5 bp เมื่อ Probe ทั้งสองทำการ Hybridization กับดีเอ็นเอเป้าหมาย จะเกิด FRET สามารถวัด fluorescence intensity ได้ในทุกช่วง Annealing ของกระบวนการ PCR

         

        การเกิดปฏิกิริยา FRET ระหว่าง oligonucleotide 2 เส้นที่ติดฉลากสาร fluorochrome ต่างชนิดกัน

        Hybridization probe สามารถนำมาตรวจสอบ amplified DNA เพื่อบ่งชี้ single point mutation หรือ single nucleotide polymorphism (SNP) ได้เป็นอย่างดี ในขณะที่ SYBR Green I Dye ไม่สามารถทำได้, โดยเมื่อเพิ่มความร้อนขึ้นอย่างต่อเนื่อง probe ที่จับกับดีเอ็นเอเป้าหมายซึ่งมีเบสบางตำแหน่งไม่คู่สม (mismatch) จะหลุดตัวออกมาก่อนในช่วงอุณหภูมิที่ต่ำกว่าในขณะที่ probe หากจับกับดีเอ็นเอเป้าหมายที่มีเบสคู่สมกันทั้งหมด (perfect match) , probe ดังกล่าวจะหลุดตัวออกจากดีเอ็นเอเป้าหมายในช่วงอุณหภูมิที่สูงกว่า

      3. Hydrolysis Probe (Taqman)
      4. Taqman Probe (Hydrolysis Probe) เป็นการใช้ Oligonucleotide เส้นเดียว โดยปลาย 5’ ของ Probe จะติดฉลาก Reporter dye โดยที่ภายในสาย Oligo Probe ห่างจาก Reporter dye ไม่เกิน 5 bp จะติดฉลากด้วย Quencher dye หลังจากการ hybridization แล้ว เมื่อ Reporter dye ถูก excite ด้วยแสง จะถ่ายเทพลังงานผ่านไปให้ Quencher dye, Quencher dye ดูดซับพลังงานนั้นไว้แล้วคายพลังงานออกมาในรูปของแสงที่มีช่วงความยาวคลื่นเพิ่มขึ้น เมื่อกระบวนการ PCR เข้าสู่ช่วงการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ (elongation) 5’exonuclease activity ของเอ็นไซม์ Taq (Thermus aquaticus) DNA polymerase จะทำการย่อย Taqman Probe, Reporter dye หลุดเป็นอิสระและห่างจาก Quencher ทำให้สามารถคายพลังงานในรูปของแสง fluorescence ได้เมื่อถูกกระตุ้นด้วยแสงพลังงานสูง

        Hydrolysis Probe (Taqman) เป็น oligo probe ติดฉลาก fluorochrome 2 ชนิด คือ Reporter dye และ Quencher dye เมื่อสาย oligo probe ถูกย่อย (hydrolyse) ด้วย Taq DNA polymerase , Reporter dye จะถูกปลดปล่อยให้เป็นอิสสระและสามารถถูกกระตุ้นให้คายพลังงานออกมาในรูปของแสง fluorescence ได้

      5. Molecular Beacons

    เป็นการสังเคราะห์ oligonucleotide probe ที่สามารถโค้งงอเป็น loop คล้ายกิ๊บหนีบผม (hair pin loop) โดยมีส่วนที่ยึดติดกันด้วยพันธะ Hydrogen bond ประมาณ 5-7 nucleotide ซึ่งมี G-C rich ทำให้ปลาย 5’ และ 3’ ติดฉลากด้วย fluorochrome และ quencher dye เข้ามาอยู่ใกล้กันจน quencher dye สามารถดูดซับพลังงานจาก fluorochrome ได้ บริเวณ loop ประมาณ 5 -30 nucleotides จะถูกสร้างให้มีลำดับเบสคู่สมกับดีเอ็นเอเป้าหมายที่เราต้องการสืบค้น เมื่อ Molecular Becon เข้าจับกับดีเอ็นเอเป้าหมาย hairpin structure จะถูกสลายไป ทำให้ fluorochrome ที่ 5’ อยู่ห่างจาก quencher dye ที่ 3’ end สามารถเปล่งแสง fluorescence ออกมาได้เมื่อถูกกระตุ้นด้วยแสง พลังงานสูง

     

     

    เมื่อ Quencher dye ถูกแยกห่างจาก Fluorophore ทำให้ Flurophore สามารถเรื่องแสงได้เมื่อถูกกระตุ้นด้วยลำแสงพลังงานสูง

     

  4. วัดปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอเป้าหมาย(quantitative assay) จากสิ่งส่งตรวจได้ แบบ real time โดยสามารถนำทั้ง SYBR Green I , Hybridization Probes, Hydrolysis probe, และ Molecular Beaconมาประยุกต์ใช้ได้
  5. หลังจากการทำ Real-time, on line PCR ด้วยเครื่อง LightCycler ของบริษัท Roche เสร็จสิ้น ข้อมูลจะถูกนำไปประมวลผลด้วยโปรแกรมคอมพิวเตอร์ของเครื่อง และแสดงผลออกมาใน 2 หน้าจอหลัก จอแรกแสดงกราฟความสัมพันธ์ระหว่างอุณหภูมิและและเวลาที่ใช้ในแต่ละรอบ (cycle) จอที่ แสดงให้ แสง fluorescence ที่เปลี่ยนแปลงใน PCR แต่ละรอบ แบบ real-time

    การคำนวณหาปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอเป้าหมายจาก unknown sample สามารถทำได้โดยใช้ standard DNA(ดีเอ็นเอเป้าหมายที่ทราบปริมาณ) มาเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมควบคู่กับดีเอ็นเอเป้าหมายที่ต้องการทราบปริมาณ (unknown DNA) ข้อมูลที่ได้จากกลุ่มของ standard DNA จะถูกนำไปสร้างเป็น calibration graph เพื่อให้กลุ่ม unknown DNA ใช้เทียบเพื่อคำนวณหาปริมาณของดีเอ็นเอตั้งต้น

    ในภาพแสดงให้เห็น ดีเอ็นเอเป้าหมาย จำนวน 106, 105 and 104 โมเลกุลถูกเพิ่มจำนวนด้วยกระบวนการ PCR, แกนY แสดงปริมาณแสง fluorescence ที่ถูกสร้างขึ้น, แกน X เป็นจำนวนรอบของ PCR หากดีเอ็นตั้งต้นมีปริมาณน้อย กระบวนการ PCR ต้องดำเนินไปหลายรอบจึงจะสามารถตรวจจับ fluorescence signal ได้ PCR cycle ที่เริ่มตรวจจับ fluorescence signal จาก standard DNA ที่ทราบปริมาณ สามารถนำมาใช้คำนวณหาปริมาณตั้งต้นของ unknown DNA ได้

    เมื่อปฏิกริยา real-time PCR เสร็จสิ้น, calibration graph จะถูกสร้างขึ้นโดยอัตโนมัติจากข้อมูลที่ได้จากการเพิ่มปริมาณ standard DNA ที่ทราบปริมาณดีเอ็นเอตั้งต้น โดยจะตรวจจับตรงจุดที่ รอบของ PCR ที่เครื่อง real-time thermocycler สามารถตรวจจับ amplification signal ที่เริ่มเข้าสู่ช่วง linear log phase (จุดดำที่แสดงในกราฟบน) แต่ละจุด (crossing point) จะเรียงตัวอยู่บน crossing line โดยจุดตัด (intersection points) เหล่านี้สามารถนำมาประมวณสร้างเป็น calibration graph ได้ (กราฟล่าง)

    calibration graph จะแสดงความสัมพันธ์ระหว่างจำนวนรอบของ PCR ที่ amplified signal ของดีเอ็นเอเป้าหมายตัดกับ crossing line และ ความเข้มข้นของ standard DNA หรือ ดีเอ็นเอเป้าหมายที่ทราบปริมาณตั้งต้น ในกรณีของ unknown sample เราสามารถใช้จุดตัดของ amplified signal (แสดงผลในลักษณะของจำนวนรอบของ PCR ) บน calibration graph มาคำนวณหาปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอเป้าหมายได้ อันเป็นหลักการที่กระบวนการ real-time PCR ใช้ในการหาปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอเป้าหมายใน unknown sample ในขณะที่ conventional PCR ไม่สามารถตรวจวัดตรวจวัดปริมาณเริ่มต้นของดีเอ็นเอเป้าหมายได้ จะบอกได้เฉพาะว่าในสิ่งส่งตรวจมีดีเอ็นเอเป้าหมายอยู่หรือไม่เท่านั้น

    Conventional PCR (End point PCR) อ่านผลจาก agarose gel electrophoresis เปรียบเทียบกับ real-time PCR ซึ่งอาศัย calibration graph มาคำนวณหาปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอเป้าหมายที่ต้องการทราบจำนวน (unknown DNA)

  6. Dynamic range และความไว (sensitivity) ของ real-time PCR จะสูงกว่าเทคโนโลยีอื่นในปัจจุบันที่ใช้สืบค้นหาปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอเป้าหมายในสิ่งส่งตรวจ dynamic range ของ real-time PCR กว้างกว่า (108) ซึ่งหมายถึงสามารถตรวจจับดีเอ็นเอเป้าหมายปริมาณเล็กน้อยไปจนถึงระดับล้านโมเลกุลได้โดยไม่ต้องเพิ่มความเข้มข้ม (concentration) หรือเจือจางดีเอ็นเอตั้งต้นเนื่องจาก crossing point ของดีเอ็นเอเป้าหมายปริมาณไม่มากไปจนถึงในระดับ 108 โมเลกุลยังอยู่บน calibration graph ในช่วง linear log phase สามารถนำไปคำนวณหาดีเอ็นตั้งต้นได้อย่างถูกต้อง

เปรียบเทียบ dynamic range และ sensitivity ของเทคโนโลยีปัจจุบันที่ใช้หาปริมาณตั้งต้นของดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอเป้าหมาย

หน่วยไวรัสวิทยาและจุลชีววิทยาโมเลกุล คณะแพทยศาสตร์ ร.พ. รามาธิบดี ได้นำ real-time PCR มาใช้ในการตรวจวินิจฉัยไวรัสจากสิ่งส่งตรวจ ทั้งในรูปแบบของ qualitative และ quantitative (viral load) หลายประเภท เช่น การตรวจหา เชื้อไวรัสตระกูล herpes (HSV, CMV, VZV, EBV) และ hepatitis B ซึ่งเป็นดีเอ็นเอไวรัส, และ HIV, dengue, HCV ซึ่งเป็นอาร์เอ็นเอไวรัส โดยสามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของไวรัส และตรวจจับ amplified product ด้วย probe ที่มีความจำเพาะใน single tube reaction ภายในเวลาไม่เกิน 1 ชั่วโมงซึ่งอยูในกรอบเวลาที่แพทย์สามารถนำผลการตรวจไปประกอบการบำบัดรักษาผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสได้ และยังช่วยลดปัญหาการเกิด carry over contamination ลงได้ร้อยละ 98

หน่วยไวรัสวิทยาและจุลชีววิทยาโมเลกุล คณะแพทยศาสตร์ ร.พ. รามาธิบดี มหาวิทยาลัยมหิดล ได้นำ real-time PCR มาประยุกต์ใช้ในการตรวจวินิจฉัยไวรัสจากสิ่งส่งตรวจตั้งแต่ปี พ.ศ. 2542